引起 ELISA 測定結(jié)果與文獻報導(dǎo)不一致的原因主要有三點,試劑因素、標本因素和操作因素。 試劑因素:1. 試劑應(yīng)選擇靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好、批間差小、操作方便的試劑。 2.不同廠家的試劑一定不能混用,包括底物和洗滌液。由于校準標準有差異,還有抗體、檢測方法、試劑、交叉反應(yīng)等因素都會導(dǎo)致對樣本的檢測結(jié)果不一致。如:有的廠家酶標板孔間 CV 值大于 20%,標記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定性比較差,使用劣質(zhì)的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽性或假陰性。 3. 要注意試劑的批號和出廠日期,雖然試劑的有效期多為 1 年,好選擇剛出廠的試劑盒。 4. 避免選擇假的 ELISA 試劑盒。有些廠家為夸大生產(chǎn) ELISA 的指標范圍,用一種指標來冒充其它指標,造成各種種屬、各種指標都可以做的假象。 標本因素和操作因素: 血清是常用的 ELISA 標本,血漿一般可視為與血清同等的標本,標本引起的假陽性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致,分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種。 內(nèi)源性物質(zhì):有人認為大約 40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì),可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有:類風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠 Ig (s) 抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。 外源性物質(zhì):外源性物質(zhì)常常是由于用于 ELISA 測定的血標本的采集、貯存等不當(dāng)所致。如標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存過久、標本凝集不全和采血管中添加物等影響。
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●穩(wěn)定轉(zhuǎn)染●:即進入細胞的質(zhì)粒整合入細胞基因組中,并能隨細胞分裂穩(wěn)定傳遞下去。這是相對瞬時轉(zhuǎn)染而言的。 瞬時轉(zhuǎn)染的表達時間短暫,外源基因?qū)胝匣蚪M的幾率非常低,絕大部分以游離形式存在,不能隨細胞分裂而一同復(fù)制,導(dǎo)致后拷貝數(shù)被稀釋,無法達到持續(xù)表達外源基因的目的。一般用轉(zhuǎn)染試劑進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,多為瞬時轉(zhuǎn)染。 ●一般如下情況需要構(gòu)建穩(wěn)定株●: 1. 長期在目的細胞中研究基因功能,通過構(gòu)建穩(wěn)定株,可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本,也極大方便實驗研究; 2. 部分蛋白半衰期極長,瞬時 RNA 只能干擾表達,無法去除已經(jīng)表達的目的蛋白,通過構(gòu)建穩(wěn)定株可以實現(xiàn)更好的基因干擾效果; 3. 瞬轉(zhuǎn)往往會引入極高拷貝數(shù)的表達,導(dǎo)致因為人為因素造成實驗結(jié)果的不**,構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細胞進行實驗研究; 4. 需要用誘導(dǎo)表達系統(tǒng)的,主要是一些致死基因或者是需要時空表達的; 5. 需要用細胞做動物實驗的,比如裸鼠成瘤等,往往需要構(gòu)建成穩(wěn)轉(zhuǎn)株。
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